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實(shí)驗(yàn)服務(wù)
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新聞資訊
Western Blot（WB，蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)）是一種通過(guò)抗原-抗體特異性結(jié)合半定量檢測(cè)樣本中目標(biāo)蛋白的技術(shù)。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，通過(guò)轉(zhuǎn)膜將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（PVDF或NC膜）上，然后用特異性抗體結(jié)合某特定抗原（目標(biāo)蛋白），再與酶或熒光標(biāo)記的第二抗體發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色以檢測(cè)目標(biāo)蛋白。現(xiàn)在Western Blot已廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測(cè)和疾病早期診斷等多個(gè)方面。
1、樣本制備：冰上使用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑）裂解細(xì)胞/組織提取蛋白質(zhì)，通過(guò)BCA法或考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)并調(diào)整樣本濃度，樣本中加入Loading Buffer煮沸。
2、SDS-PAGE電泳：根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量選擇分離膠濃度進(jìn)行制膠，上樣時(shí)在凝膠兩側(cè)孔中加Marker，其他樣本上樣量一致，恒壓電泳。
3、轉(zhuǎn)膜：濕轉(zhuǎn)法廣泛用于各種分子量的蛋白質(zhì)，更適合大分子蛋白，凝膠、膜和濾紙疊放制成“三明治”在轉(zhuǎn)膜液中恒流轉(zhuǎn)膜。半干轉(zhuǎn)法適合小分子蛋白，預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液浸泡“三明治”后轉(zhuǎn)膜。
4、封閉：5%脫脂奶粉或BSA封閉1小時(shí)，避免非特異性結(jié)合。
5、抗體孵育：一抗4℃過(guò)夜孵育。二抗室溫避光孵育1小時(shí)。
6、顯影與分析：ECL試劑盒A/B液1:1混合孵育膜，化學(xué)發(fā)光成像儀捕獲信號(hào)。
7、結(jié)果判讀：通過(guò)ImageJ分析條帶灰度值，目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值=相對(duì)表達(dá)量。
1、組織樣本：冰上采集新鮮組織，要求1cm3大小，注意去除非研究組織部分，并用預(yù)冷的生理鹽水或1×PBS清洗干凈，放入標(biāo)記好的凍存管中，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，干冰運(yùn)輸。
2、細(xì)胞樣本：
（1）貼壁細(xì)胞：至少提供1×107個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞棄去培養(yǎng)上清液，預(yù)冷PBS清洗1-2次，加少量預(yù)冷PBS用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，（或者細(xì)胞用胰酶消化后低速離心棄去上清液，PBS清洗1-2次）轉(zhuǎn)入1.5ml離心管或凍存管中，低速離心（4℃ 1500rpm，5min）棄去上清，細(xì)胞沉淀用液氮速凍，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，干冰運(yùn)輸。
（2）懸浮細(xì)胞：至少提供1×107個(gè)細(xì)胞。低速離心去除培養(yǎng)液，PBS清洗1-2次，轉(zhuǎn)入 1.5ml 離心管中，低速離心（4℃ 1500rpm，5min）沉淀細(xì)胞，棄去PBS，細(xì)胞沉淀用液氮速凍，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，干冰運(yùn)輸。
3、全血樣本：
（1）如果需要血細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）：2-3ml新鮮血液使用抗凝管（EDTA 紫蓋或肝素綠蓋）收集，上下顛倒混合均勻，4℃保存，2h內(nèi)使用細(xì)胞分離液（貨號(hào)U22-420B）分離出淋巴細(xì)胞，-80℃冰箱保存，干冰運(yùn)輸。
（2）如果需要血清：2-3ml新鮮血液室溫靜置凝固10-20min，離心（2000-3000rpm，20min）收集上清，-80℃冰箱保存，干冰運(yùn)輸。
（3）如果需要血漿：2-3ml新鮮血液使用抗凝管（EDTA 紫蓋或肝素綠蓋）收集，上下顛倒混合均勻，4℃保存，離心（2000-3000rpm，20min）收集上清，-80℃冰箱保存，干冰運(yùn)輸。 (注意：避免將全血樣本放入-20℃或者-80℃保存。)
4、蛋白樣本：提取好的蛋白樣本加入loading buffer變性-80℃冰箱保存，干冰運(yùn)輸。。
5、其他樣本：菌液、材料蛋白、外泌體、精液、卵母細(xì)胞等樣本保證蛋白含量充足，干冰運(yùn)輸。
1、樣本量充足：實(shí)驗(yàn)要求有足量且保證一定純度的樣本，一般要求107個(gè)細(xì)胞或者1cm3大小的組織。
2、取材迅速：取動(dòng)物組織時(shí)要在冰上快速取材，盡量清洗干凈去除血液等污漬，避免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
3、無(wú)菌環(huán)境：將組織或細(xì)胞等樣本迅速轉(zhuǎn)移至無(wú)菌無(wú)酶的凍存管中。
4、標(biāo)記清楚：取樣前在凍存管上用防水記號(hào)筆做好標(biāo)記，并記錄清楚。
5、快速凍存：樣本處理好后盡快轉(zhuǎn)移至液氮或-80℃中速凍。
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