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實(shí)驗(yàn)服務(wù)
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新聞資訊
克隆形成實(shí)驗(yàn)是測(cè)定細(xì)胞存活率和考察單個(gè)細(xì)胞增殖能力的有效方法之一。單個(gè)細(xì)胞在體外連續(xù)6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體稱為集落或克隆。每個(gè)克隆大小在0.3-1.0mm，含有50個(gè)以上的細(xì)胞，通過計(jì)數(shù)克隆形成率，可對(duì)單個(gè)細(xì)胞的增殖潛力做定量分析，常用的手段有兩個(gè)：平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)。
平板克隆形成實(shí)驗(yàn)直接將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿中，優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、細(xì)胞間分泌的促生長(zhǎng)因子可在培養(yǎng)液中擴(kuò)散、克隆形成率高，適用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞; 缺點(diǎn)是細(xì)胞在貼壁前容易移動(dòng)。
軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)采用半固體培養(yǎng)基模擬體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境，適用于懸浮細(xì)胞及不依賴于貼壁生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞。在懸浮狀態(tài)下不能增殖的細(xì)胞（如正常成纖維細(xì)胞）不適用此法。這種方法可用于細(xì)胞分化的基礎(chǔ)研究和臨床腫瘤治療的療效檢驗(yàn)等方面。
克隆形成實(shí)驗(yàn)可以：
1）檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)干預(yù)后的克隆形成能力來判斷干預(yù)后是否影響細(xì)胞的增殖和存活能力；
2）驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物、放療等在增殖能力方面的敏感性;
3）評(píng)價(jià)細(xì)胞在體內(nèi)成瘤性：腫瘤細(xì)胞如果體外克隆形成能力越強(qiáng)，即表明體內(nèi)成瘤性越強(qiáng)。
（一）平板克隆形成實(shí)驗(yàn)
1、單細(xì)胞懸液制備：使用0.25%胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，離心收集細(xì)胞沉淀，重懸并輕柔吹打成單個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞懸浮于含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中；臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)估活細(xì)胞率（要求>90%），并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整濃度，可倍比稀釋至1×103個(gè)/ml（通常貼壁細(xì)胞接種密度為100-1000個(gè)/孔）。
2、接種與給藥：?jiǎn)渭?xì)胞懸液以每孔50、100、200個(gè)細(xì)胞的梯度密度均勻接種至6孔板或培養(yǎng)皿；若需藥物處理，在接種細(xì)胞24h-72h加入藥物；
3、克隆培養(yǎng)：靜置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，每3天換液一次并觀察克隆形成情況；當(dāng)克隆直徑達(dá)0.3-1.0mm（肉眼可見）時(shí)終止培養(yǎng)；
4、固定染色：PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30-60min；結(jié)晶紫或Giemsa染色10-30min，去除殘留染液并干燥；
5、計(jì)數(shù)分析：顯微鏡下計(jì)數(shù)含50個(gè)以上細(xì)胞的克�。皇褂肐mageJ等軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算克隆形成率�？寺⌒纬陕使剑嚎寺⌒纬陕�=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%，細(xì)胞克隆形成率即細(xì)胞接種存活率，表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量。
（二）軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)
1、準(zhǔn)備瓊脂：制備1.2%和0.7%的瓊脂，高壓滅菌，在40℃恒溫水浴鍋中維持液態(tài)；
2、制備底層瓊脂：將1.2%瓊脂與2×完全培養(yǎng)基以1:1混合（不包含細(xì)胞）后鋪于6孔板中，總體積1.5mL，37℃孵育30min使其凝固；
3、制備上層細(xì)胞懸液：按1:1的比例將0.7%的瓊脂與2×完全培養(yǎng)基混勻（維持40-42℃，避免凝固），加入0.2mL的單細(xì)胞懸液，充分混勻，再加入6孔板中作為上層膠，每孔1.5mL，每孔500-5000個(gè)細(xì)胞。37℃孵育至凝固，在最上層加入1ml完全培養(yǎng)基，防止瓊脂干燥；
4、細(xì)胞克隆培養(yǎng)：置于37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-3周，每3天換液一次，并觀察細(xì)胞狀態(tài)及克隆形成情況；當(dāng)克隆直徑達(dá)0.3-1.0mm（肉眼可見）時(shí)終止培養(yǎng)；
5、固定染色：PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30-60min；結(jié)晶紫或Giemsa染色10-30min，去除殘留染液并干燥；
6、數(shù)據(jù)分析：顯微鏡下計(jì)數(shù)含50個(gè)以上細(xì)胞的克��；使用ImageJ等軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算克隆形成率�？寺⌒纬陕使剑嚎寺⌒纬陕�=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100% ，細(xì)胞克隆形成率即細(xì)胞接種存活率，表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量。
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