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細胞增殖是生物體生長、發(fā)育、繁殖以及遺傳的基礎(chǔ)，是生物體的重要生命特征。細胞增殖檢測是評估正常細胞的健康狀況、測定對毒性損傷的反應和抗腫瘤藥效等最常見的方法。細胞增殖實驗方法主要可分為三類：基于代謝活性的檢測（如MTT/CCK8）、基于DNA合成的檢測（如BrdU/EdU）和基于增殖標志物表達的檢測（如Ki67）。
（一）基于代謝活性的檢測：MTT和CCK8法通過測量活細胞中線粒體脫氫酶的活性來評估細胞增殖，特別適用于高通量藥物篩選和毒性測試。
MTT法的原理：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)ⅫS色的MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞則無此功能。隨后使用二甲基亞砜（DMSO）等有機溶劑溶解這些結(jié)晶，通過酶標儀在490nm波長附近測定其吸光度值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。
CCK8法是MTT的改進方法，其原理類似：CCK-8試劑中含有WST-8（一種水溶性四唑鹽），在電子耦合試劑存在的情況下，能夠被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物（Formazan）。產(chǎn)生的Formazan量與活細胞數(shù)量成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標儀在450nm波長處測定吸光度值，即可間接反映活細胞數(shù)量。CCK8法避免了MTT法中的結(jié)晶溶解步驟，操作更為簡便。
（二）基于DNA合成的檢測：BrdU和EdU法通過標記新合成的DNA來直接反映細胞增殖情況，特別適用于細胞周期分析和精準的增殖檢測。
BrdU法的原理：BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）作為一種胸腺嘧啶核苷的類似物，在細胞DNA合成期（S期）能夠代替胸腺嘧啶（T）摻入到新合成的DNA鏈中。隨后通過特異性抗BrdU抗體與摻入的BrdU發(fā)生免疫反應，經(jīng)顯色或熒光檢測即可識別正在進行DNA合成的增殖細胞。傳統(tǒng)的BrdU檢測需要進行DNA變性處理（如酸解、熱解或酶解）使抗體能夠接近BrdU抗原，這可能會損傷樣品和影響細胞形態(tài)。
EdU法是BrdU的改進方法，其原理類似：EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）也是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在DNA合成期（S期）代替胸腺嘧啶摻入新合成的DNA分子中。不同的是，EdU檢測利用點擊化學原理，EdU分子中的乙炔基能與熒光染料標記的疊氮化物發(fā)生高效特異性反應，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，從而直接標記新合成的DNA。這種方法無需DNA變性和抗體識別，避免了樣品損傷，操作更為簡便快捷。
（三）基于增殖標志物表達的檢測：Ki67免疫熒光檢測是一種基于增殖相關(guān)核抗原表達的細胞增殖分析方法。Ki67蛋白是一種與細胞增殖相關(guān)的核抗原，在細胞周期的G1、S、G2和M期均有表達，而在靜止期（G0期）幾乎不表達，因而Ki67成為評估細胞增殖狀態(tài)的理想標志物。
Ki67檢測的原理：利用特異性抗Ki67抗體與細胞中表達的Ki67蛋白結(jié)合，再通過熒光標記的二抗進行檢測和顯色。Ki67陽性表明細胞處于活躍增殖狀態(tài)，通過計算Ki67陽性細胞的比例（Ki67指數(shù)），可以評估細胞群體的增殖活性。Ki67指數(shù)越高，通常表示細胞增殖越活躍。
（一）MTT/CCK8實驗
1、取對數(shù)生長期的細胞，消化制備單細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細胞濃度。將細胞懸液接種于96孔板中，每孔通常接種100μl含適當數(shù)量細胞的培養(yǎng)基（貼壁細胞需預培養(yǎng)過夜使細胞貼壁，懸浮細胞則無需此步驟）。設(shè)置空白對照組、陰性對照組和實驗組，每組設(shè)置3-6個復孔。
2、根據(jù)實驗設(shè)計，向孔板中的細胞添加藥物、基因干預等處理，繼續(xù)培養(yǎng)24-72小時，具體取決于實驗目的和細胞類型。
3、加入試劑并孵育：
（1）MTT法：每孔加入10μl MTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)箱中孵育4小時。若藥物可能與MTT反應，需先離心棄去培養(yǎng)液，用PBS輕輕清洗2-3次后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。
（2）CCK8法：每孔直接加入10μl CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5-4h（孵育時間需預先摸索）。
4、測定吸光度：
（1）MTT法：孵育后小心吸棄上清液，每孔加入150μl DMSO，輕微振蕩使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測量各孔的吸光值。
（2）CCK8法：孵育后直接使用酶標儀在450nm波長處測定吸光度（無需更換培養(yǎng)基和添加溶解液）。
5、計算各組復孔的平均吸光度值，計算細胞存活率或抑制率。
（二）BrdU/EdU滲入實驗
1、取對數(shù)生長期的細胞接種于培養(yǎng)板中，當細胞匯合度達60-90%時，在培養(yǎng)基中加入BrdU或EdU工作液。
BrdU法：通常使用10μM BrdU工作液，避光培養(yǎng)0.5-48h（根據(jù)實驗目的調(diào)整）。
EdU法：通常使用50μM EdU工作液，避光培養(yǎng)6-7h。
2、棄去培養(yǎng)液，PBS清洗細胞2次。4%多聚甲醛室溫固定15-30min。棄去固定液，PBS清洗后加入0.5% Triton X-100室溫通透10-15min。
3、檢測反應：
（1）BrdU法：DNA變性處理（如DNase I處理或酸變性）使雙鏈DNA解鏈暴露BrdU抗原。然后加入抗BrdU一抗孵育，再加入熒光標記的二抗孵育。
（2）EdU法：無需DNA變性和抗體步驟，直接加入Click反應混合液（含熒光染料標記的疊氮化物）避光反應30min。
4、DNA復染與檢測：使用DNA染料（如DAPI、PI或Hoechst）進行細胞核復染，用PBS清洗后，在熒光顯微鏡或流式細胞儀下觀察和分析。BrdU/EdU陽性細胞顯示特異性熒光信號，表明這些細胞處于活躍增殖狀態(tài)。
（三）Ki67免疫熒光實驗
1、樣本制備與固定：
（1）細胞樣品：對數(shù)生長期細胞用4%多聚甲醛固定15-30min，PBS清洗。
（2）組織樣品：新鮮組織樣本用4%多聚甲醛固定固定24-48h后進行石蠟包埋和切片，或進行冰凍切片。
2、通透與封閉：對于細胞樣品，加入0.5% Triton X-100室溫通透10-15min。對于組織切片，脫蠟和復水處理（石蠟切片）后加入封閉液室溫封閉30-60min。
3、一抗孵育：加入稀釋的抗Ki67一抗，4℃濕盒中過夜孵育或室溫孵育2-4h。
4、二抗孵育：PBS清洗3次，每次5min，加入熒光標記（如FITC）的二抗，室溫避光孵育1-2h。
5、DNA復染與封片：PBS清洗3次，每次5min，加入DNA染料（如DAPI）復染細胞核5-10min。PBS清洗后，用抗熒光淬滅封片劑封片。
6、在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄，觀察Ki67陽性信號和DNA復染信號（藍色）。隨機選擇多個視野，計數(shù)至少500個細胞中的Ki67陽性細胞數(shù)，計算Ki67指數(shù)（陽性百分比）。
1、BrdU檢測通常使用FITC標記的抗體，與GFP熒光蛋白一般不兼容，存在光譜重疊風險。
2、Ki67免疫熒光通常使用FITC或Cy3等熒光標記，與GFP/RFP等熒光蛋白一般不兼容，存在光譜重疊風險。
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